A hígított kansperma minőségének ellenőrzése

Minden kantelepnek rendszeresen ellenőriznie kell az ott termelt és vásárlóinak kiadott hígított spermaadagokat, akár belső minőségvizsgálattal, akár harmadik fél bevonásával, hogy biztosak legyenek benne, minden adag kiváló termékenyítő képességű. A minőségellenőrzési programnak meg kell határoznia a spermiumok számát dózisonként, a spermiumok motilitását, morfológiáját, és potenciális fertőzöttségét mikroorganizmusokkal.

A sertéstelepen az új genetika bevezetésének legkönnyebb módja, ha kiválasztunk egy genetikai vonalat, megvesszük a hígított spermát egy kanállomástól, és mesterséges termékenyítést alkalmazva bevisszük a telepre. Ez nagy felelősség, és csakis minőségileg kifogástalan termékenyítő adagok átadását jelentheti.

A kanállomáson előállított hígított spermával a genetikai vállalat hozzájárulása egy termelő reprodukciós teljesítményéhez alapvetően 50%-ra tehető. Jelen cikk célja, hogy áttekintse a minőségellenőrzési vizsgálatokat, amiket a hígított spermával minden egyes kantelepen el kell végezni. A hígított termékenyítő adagokat sertéstartók használják fel, akiknek a legjobb minőséget kell kapniuk a süldők és kocák termékenyítéséhez a megfelelő időben.

A minőség-ellenőrzés elvégzésének okai

A cél az alábbi jellemzőkkel rendelkező termék biztosítása a termékenyítéshez:
  • Fertőző organizmusok/betegségek hiánya.
  • Maximális élettartam.
  • Maximális fertilitás.

Ahhoz, hogy ezeket a jellemzőket biztosítsuk, a kanállomásoknak rendszeresen ellenőrizniük kell az általuk termelt adagok állapotát. Ehhez választhatják a saját belső vizsgálatot, vagy használhatják egy harmadik fél szolgáltatásait.

Az ágazati szabványok szerint minden dózismintán az alábbi jellemzőket kell vizsgálni:
  • mennyiség,
  • spermium motilitás,
  • spermium morfológiai paraméterek,
  • spermiumkoncentráció,
  • összes spermiumszám dózisonként.

Harmadik fél megbízásának előnye a fenti vizsgálatok elvégzésével, hogy az eredmények objektivitása nem vonható kétségbe.

A minőségellenőrzési teszt lépései

A vizsgálandó minták száma és milyen gyakran vizsgáljunk.

A vizsgálandó mintákat (tubusokat, zacskókat) véletlenszerűen választjuk ki, és a tesztminták mennyisége függ a kanállomáson naponta előállított spermaadagok (tételek) számától. Statisztikai szempontból a naponta nagy mennyiségű dózist előállító kantelepeken a minőségellenőrzési vizsgálatot 200 dózisonként kell elvégezni. A kisebb mennyiségeket produkáló kanállomásokon a tételekből a mintákat véletlenszerűen vesszük, és küldjük a laborba a 200 adag megtermelése közben.

Gyakorlati szempontból ideális, ha a kanállomás rendszeres időközönként teszteli a hígított kanspermát. Bizonyos kanállomások minőségellenőrző laboratóriummal állnak szerződésben, ahol rendszeresen, hetente, kéthetente vagy havonta vizsgálják a mintákat, évente előre meghatározott rend szerint. Ez a rendszer lehetővé teszi, hogy termelésük minden lépését időszakonként ellenőrizzék, és a kanállomáson bekövetkező minden változás megjelenhet a tesztelt mintákban. Így pl. a változás a személyzetben, a vízellátásban, a spermavétel és spermavételhez és kezeléshez használt eszközök higiéniájában, stb., mind tetten érhető.

A minták szállítása

A mintákat hűtött, 17 fokot biztosító akkukat tartalmazó dobozba (pl. Styrofoam) helyezzük, hogy a gyűjtött mintákat a megfelelő hőmérsékleten tartsuk. A mintáknak 24 órán belül meg kell érkezniük a vizsgálat helyszínére. A szállítás alapvetően egyezzen meg azzal, ahogyan minden vevő megkapja a termékenyítő adagokat.

A sperma hőmérséklete

Amint a minták beérkeznek a laborba, meg kell mérni azok érkezéskori hőmérsékletét, amihez megfelelő eszköz az infravörös hőmérő. Az ideális hőmérséklet az érkezéskor 16-18 fok. Ez az ellenőrzés jelzi, hogy a kanállomás szállítási protokollja jól működik, fenntartva a sperma számára megfelelő hőfokot, vagy szükség van valamilyen változtatásra. Fontos tudni, hogy a 16-18 foknál alacsonyabb vagy magasabb hőmérséklet hatással lehet a spermiumokra, és felhasználása után reprodukciós problémákat okozhat.

A dózis mennyisége

A dózis mennyiségének meghatározásához minden tubust/tasakot precíziós mérleggel mérnek meg. 1 gramm megfelel 1 ml hígított spermának. A sertéságazatban szabványosan használt spermaadagok mennyisége 60-80 ml. A kanállomások arra törekszenek, hogy adagjaik egyformák legyenek.

A spermiumok egyedi motilitása

Ezt a vizsgálatot az életképes spermiumok dózisonkénti százalékos arányának meghatározására alkalmazzák. Elvégzésére ideális esetben olyan eszközt használnak, amely objektív módon és pontosan ítéli meg a motilis spermiumok számát és százalékos arányát. Erre valók a piacon is beszerezhető számítógéppel támogatott spermavizsgáló rendszerek. Ezek állnak egy számítógéphez csatlakozó kamerából, amit a mintát vizsgáló trinokuláris mikroszkópra helyeznek. A kamera 30 fotót készít a mintaterületről, gyors egymásutánban fél másodperc alatt, ami elegendő idő a számítógépnek a spermiumok egyedi felismeréséhez és mozgásuk jellegének elemzéséhez. Általában 7 látóteret elemeznek mintánként a motilitás pontos értékének megállapításához. A mintában a motilitásnak legalább 70%-osnak kell lennie. Elvárás az is, hogy a mozgó sejtek egyenesen előrehaladó mozgást végezzenek (progresszív motilitás).

Az egyedi motilitás vizsgálata következtetni enged a sejtmembrán épségére és a spermiumok megfelelő morfológiájára.

Koncentráció és a minta összes spermiumszáma

Az első lépés a spermiumok koncentrációjának meghatározása 1 ml hígított spermában. A spermaadagban lévő spermiumok nagy száma miatt szükséges a minta hígítása ismert hígítási fokban, ezzel lehetővé téve az egyes sejtek manuális számlálását. A milliliterenkénti spermium koncentrációt ezután úgy határozzák meg, hogy a hígított spermaoldatot haemocitométerbe töltik, és a sejteket manuálisan megszámlálják fáziskontraszt mikroszkóp alatt. Ezután ismert képlet szerint matematikai számítást végeznek, a hígítási fokból és a megszámlált sejtekből kiindulva. Az így kapott értéket felszorozva a dózis teljes mennyiségével kapjuk meg a dózisban jelen lévő összes spermiumszámot.

Ennek a lépésnek alternatív elvégzési módja a számítógépes rendszer. A motilitásvizsgálattal egy időben a rendszer képes a ml-enkénti spermiumszám meghatározására is. Végül a képernyőn feltünteti a dózis összes spermiumszámát. A haemocitométerrel végzett vizsgálat kombinálható a számítógépes analízissel.

micro

Spermium morfológiai vizsgálat

Általános morfológia

Ezt a vizsgálatot annak érdekében végzik el, hogy általános képet kapjanak a vizsgált mintában lévő spermiumok alakjáról, illetve bármilyen látható abnormalitásról. A vizsgálatot fénymikroszkóp alatt végezzük kis felbontású objektívvel, aminek során megszámláljuk a normális és abnormális sejteket. Az ezzel a módszerrel megfigyelhető morfológiai elváltozások az abnormális fej és farok, plazmacseppek és a ferde fej. A vizsgálatnak ez a formája nem alkalmas az akroszóma, DNS vakuólumok és más olyan spermium morfológiai hibák megfigyelésére, melyek nagyobb felbontást és a sejtek megfestését igénylik.

Az általános morfológiai vizsgálatra alkalmas a fent bemutatott számítógéphez kapcsolt mikroszkópos rendszer.

Részletes differenciáló morfológia

Mivel a sejtek áttetszők a fénymikroszkópos vizsgálat során, speciális mikroszkópos módszerre vagy a sejtek megfestésére van szükség a minta sejtjeinek alapos és részletes vizsgálatához, különösen, ha reprodukciós szubfertilitásra gyanakszunk. Nedves minta esetén a hígított sperma egy cseppjét tárgylemezre helyezzük, a sejteket egy kis cseppnyi glutáraldehiddel mozdulatlanná tesszük, majd fedőlemezzel fedjük.  A nedves minta esetén a differenciáló morfológiai vizsgálatot immerziós olajjal, 1000x nagyításban speciális mikroszkópos optikai technológiával, mint a fáziskontraszt, vagy a differenciáló interferencia kontraszt kell elvégezni.

A részletes differenciáló morfológiai vizsgálat másik lehetősége a hígított spermakenet megfestése eosin-nigrosin festéssel, majd vizsgálata 1000x-es nagyításban, immerziós olaj alatt, fény- vagy fáziskontraszt mikroszkópot alkalmazva.

Bármelyik módszert is választjuk, mintánként legalább 100 spermiumot kell megvizsgálni és morfológiai kategóriákba sorolni. A besorolási kategóriák száma függ a vizsgáló személy képzettségétől, illetve attól, mennyire érzi biztosnak magát a vizsgálathoz. A differenciáló morfológiában általánosságban használt kategóriák a normál sejt, fej, farok rendellenességek és plazmacseppek. A kategóriák kiterjeszthetők olyanokra, mint pl. akroszóma rendellenességek, ferde fej, középrész-elváltozások, proximális és disztális plazmacsepp, teratoid sejtek, egyéb jelenlévő sejtek, stb.

Bakteriológia

A bakteriospermia, vagyis a kansperma fertőzöttsége baktériumokkal igen gyakori jelenség az összegyűjtött kanspermában. Habár a kan nemi útjai mentesek a baktériumoktól, a gyűjtés után az ejakulátum erősen szennyezett baktériumokkal, 10 2-10 6 számú mikroorganizmust tartalmazva ml-enként. A sperma baktériumos szennyeződésének elsődleges forrása a kan, de több más fertőzési forrás is szerepet játszik, mint az istálló környezete, az istállóban és a laborban dolgozók, a sperma hígítására felhasznált víz. A sperma általában a spermavétel során fertőződik, ahol a prepucium (tasak) váladék, a bélsár, a szőr és a bőr a szennyező források. Nagyon fontos szerepe van a fertőzésben a spermavételt végző személy kezének, a spermavétel, kezelés és hígítás eszközeinek. A fertőzésben részt vevő baktériumok között első helyen áll az Enterobacteriaceae család. Az irodalomban leggyakrabban emlegetett baktériumok a Stenotrophomonas maltophilia (15.4%), Alcaligenes xylosoxidans (10.3%), Serratia marcescens (10.3%), Acinetobacter lwoffi (7.7%), Escherichia coli (6.4%), Pseudomonas spp (6.4%) és egyéb fajok (23.0%). Egy utóbbi visszatekintő tanulmány, melyben 123 kanadai kanállomásról gyűjtött minták fertőzöttségét vizsgálták, a leggyakrabban kinőtt baktériumok a Pseudomonas spp fajai voltak (25%). Őket követték az Acinetobacter spp (9.7%), Escherichia coli (6.4%), Staphylococcus spp (6.4%), Citrobacter spp (6.4%), és Shewanellaputrefaciens (3.2%).

A baktériumokkal nagymértékben szennyezett sperma csökkent fertilitáshoz, alacsonyabb vemhesülési arányhoz és a termékenyítő adagok rövid élettartamához vezetnek. A bakteriospermia a sperma minőségét a spermiumok motilitásának csökkentésével, a sejtek pusztításával és az akroszóma károsításával rontja. A baktériumokkal súlyosan szennyezett spermával termékenyített kocáknál hüvelybántalmak és endometritis jelentkezhet. Ezért fontos kihangsúlyozni a kanállomás dolgozóinak a higiénikus spermagyűjtés és kezelés fontosságát. A labor helyiségeinek és eszközeinek alapos tisztítása és fertőtlenítése szintén szükséges, a spermahígítókhoz pedig antibiotikumot adnak a spermiumok épségének megőrzése érdekében.

A bakteriospermia kockázata miatt a kanállomásoknak tanácsos a hígított sperma minőségellenőrzését kérniük a fertőző baktériumok kiszűrésére. Minden spermamintát 5% véres agar táptalajra kennek ki, és 37 fokon legalább 24 órán át inkubálják, így állapítva meg a mikroorganizmusok esetleges jelenlétét. Ideális esetben nem nő ki baktériumtelep a tenyésztés hatására.

Ha bármely hígított spermamintában baktériumnövekedést tapasztalnak, azonosítani kell a baktériumfajt, és érzékenységi, illetve minimális gátló koncentráció (MIC) tesztet végeznek annak megállapítására, hogy mely antibiotikumok alkalmasak az adott baktérium visszaszorítására.

A minőségellenőrzést ki kell terjeszteni a kanállomás laboratóriumára is. Fontos, hogy a labor egyes kiemelt területeit rendszeresen ellenőrizzék a mikroorganizmusok jelenlétére. A mintavétel helyei azok, amelyek érintkezésbe kerülhetnek a spermával és a hígítóval, illetve azok, amelyek általában melegek és nedvesek. Példa az ilyen területekre a vízvezeték, a víz és hígító továbbítására használt csővezetékek, pipettahegyek, hígítóedények, spermagyűjtő edények, inkubátorok, vízfürdők, melegítődobozok stb.

Összefoglalva megállapíthatjuk, hogy a saját és hatósági ellenőrzéseket megtartó kanállomások a termékenyítő anyag minőségét, biztonságát tekintve a mesterséges termékenyítés legmagasabb szintű szereplői. A folytatásban a kanspermával átvihető betegségeket tekintjük át, szintén a kanállomások szemszögéből.

Forrás:

Mario Baracaldo, DVM, MVSc, Dip. ACT and Jim Ward, BSc. Agr.
Minitube Canada

Összeállította: dr. Wekerle Balázs